黴漿菌檢測最新國際法規解析：PCR 與 NAT 方法在細胞治療的應用

黴漿菌(Mycoplasma)污染一直是細胞培養與生物製藥過程中最棘手的問題之一。由於其體積小、無細胞壁、且能在培養基中高濃度生長而不致使培養液混濁，黴漿菌污染往往難以察覺，卻可能造成細胞功能異常、產品品質下降，甚至引發病患安全風險。近年來，隨著細胞治療產品（ATMPs）的快速發展，國際間對黴漿菌檢測的法規也有了重大更新，尤其是 PCR 與其他核酸擴增技術（NAT）的正式納入，為產業帶來新的挑戰與契機。

細胞株目前已被廣泛地用於生產許多治療或醫學用途的生物產品，包括細胞因子、病毒疫苗、單株抗體和生長因子。對於生物製藥的生產，黴漿菌的污染可導致細胞產量減少並可能影響產品的質量。此外，如果黴漿菌污染物存在於最終的生物製品中，它可能會直接影響病患的安全。在財物的損失上，受到黴漿菌污染的該批次產品必須銷毀，此外，還需要花費許多時間及費用去調查汙染源，並再次進行設備的清潔，這可能導致數月的寶貴生產時間損失以及數十萬美元的相關費用。

近年來，隨著細胞治療的應用興起，黴漿菌的檢驗也變成了必要的項目，用於治療用途的細胞產品本身則更不能有黴漿菌的汙染發生，因為這不僅將導致細胞本體的品質受到很大的影響，且更可能會引發細菌感染，因此為了確保細胞製品及其生產過程不受黴漿菌的汙染，進行檢驗則是非常必要之品管過程。

台灣TFDA在其所頒布的”人類細胞治療產品查驗登記審查基準”中也提到在細胞產品的特性分析中必需做微生物測試，其中就包含了黴漿菌的檢測，主要就是要確保產品與製造過程中所使用的原物料沒有遭受黴漿菌的汙染，至於檢測方式則可以參考TFDA所公告之「生物藥品檢驗基準 III」或中華藥典。

黴漿菌的檢測

針對黴漿菌的檢測方法及細節，在生物藥品檢驗基準中已有詳細的介紹，主要的偵測方法共分成三種，分別是培養基培養法(culture)、指示細胞培養法(Indicator, Hoechst DNA stain)及聚合酶鏈鎖反應測試法(PCR NTA-base)，其中直接培養基培養法的形式進行檢測是相對較耗時費力，最多需要28天才能完成，此方法的使用在時間上會有較大的限制，某些產品的半衰期可能較短，無法等這麼久，尤其是活細胞，此外，培養測定的靈敏度可能會受到一些其他因素的影響；例如，培養基成分的品質、培養基製備的穩定性、黴槳菌培養的操作或黴漿菌標準品的缺乏。

而檢驗黴漿菌污染的另一個替代方法是使用聚合酶鏈鎖反應(PCR)，從法規的可行性來看，PCR的檢測方法在經過適當的確效評估後是可以替代前面兩種檢測方法，且PCR也已經被證明是一種快速可靠的替代方法，此方法也非常適合在實驗室操作，此外，PCR具有高敏感性、特異性、可靠性、速度快且其檢測成本相對較低，但主要缺點是無法區分活的黴漿菌和死的黴漿菌。但PCR的實驗條件也需要做一些測試，並搭配適合的positive, negative及internal control一起進行，以避免可能出現的偽陽性或偽陰性。目前，許多基於PCR的方法都是以黴槳菌基因組16S rRNA區域當作擴增的目標，為了確保該方法的特異性，在PCR的引子的設計就必須要特別注意其特異性，必須盡可能防止黴槳菌以外的細菌被偵測到。

PCR的檢測方式對於細胞治療的應用也顯得更加重要，因為PCR能夠快速地進行實驗及分析結果，適合用於替代直接培養法及指示細胞培養法，因為在某些細胞治療的應用是必需使用非凍存過的細胞，也就是細胞在體外培養後不再經過冷凍保存的步驟，需在短時間內要直接施打到病患體內，有時效性的問題，那麼使用PCR的檢測方式是非常合適的方法；但若可使用解凍後的細胞進行施打，相對時間上彈性較高，則不一定要選用PCR的方式來檢測，而可以選擇在細胞凍存之前使用直接培養法做檢測。

而目前市面上有許多已經商品化的PCR kit可以選購，因此這也是目前較常被使用的檢測方法，但若選擇使用PCR方法，則依照TFDA的規範，是必需要去對其敏感度、專一性及耐變性去進行確效，另外，中華藥典(7009)也有針對黴漿菌的檢測方法有詳細的說明，其中「7009.1 以核酸擴增技術檢測黴漿菌之分析方法確效指引」中也清楚說明如何針對市售的PCR套組進行產品的確效。而PCR方法的確效主要需要注意幾點，若要取代培養基培養法，則其對黴漿菌應能檢出達10CFU/mL，而若要取代指示細胞培養法則敏感度應能檢出達100 CFU/ml；另外，在實驗的對照組部分則可以設計包含有internal control、positive control和negative control，其中使用internal control是可以確保待測檢體本身並不含有抑制PCR反應的物質，避免實驗出現偽陰性的狀況。

最新的國際法規已經大幅更新了黴漿菌檢測要求

歐洲藥典（EP）2.6.7 專論（2026 年 4 月生效）

首次明確承認 PCR、qPCR、dPCR 等 NAT 方法可獨立使用。
要求靈敏度 ≤10 CFU/mL 或 <100 GC/mL。
引入 基因拷貝數（GC）標準，與 CFU 並行。
規範 GC/CFU 比值需小於 10，確保標準品可比性。
強制進行 產品特異性適用性測試，避免基質抑制影響檢測。

美國藥典（USP）<77> 專章（2026 年 10 月生效）

與 EP 相呼應，建立 NAT 方法的明確規範。
要求 外部陽性對照（external positive control），確保檢測靈敏度在真實條件下達標。

台灣法規現況

TFDA：在「人類細胞治療產品查驗登記審查基準」中要求進行微生物檢測，其中包含黴漿菌。
檢測依據：目前仍以「生物藥品檢驗基準 III」及中華藥典為主。
PCR 套組確效：依照中華藥典 7009.1，必須針對市售 PCR kit 進行敏感度、專一性及耐變性確效。

對產業的影響

檢測套組選擇：必須符合 EP/USP 的靈敏度要求，並提供驗證報告。
內部確效：建議製造商自行建立確效流程，並使用國際認可的標準品（10 CFU、100 GC）。
品管流程：同時檢測細胞與上清液，並進行基質抑制測試。
法規趨勢：PCR 與 qPCR 已成為國際標準方法，未來台灣也可能全面採用。

強化品管流程，確保產品安全與合規

PCR 與 qPCR 已成為國際標準方法，不再只是替代方案，建議儘早導入符合 EP 2.6.7 與 USP <77> 的檢測流程，並建立內部確效方法，使用國際認可的標準品（10 CFU、100 GC）。

PCR 與培養法比較表

檢測方法	優點	缺點	檢測時間	靈敏度要求
培養基培養法	– 傳統標準方法 – 能區分活菌	– 耗時長（28 天） – 需高品質培養基 – 不適合短半衰期產品	約 2–4 週	10 CFU/mL
指示細胞法	– 可視化染色顯示 – 適合部分細胞株	– 操作繁瑣 – 靈敏度有限	約 2 週	100 CFU/mL
PCR / qPCR / dPCR	– 快速（數小時完成） – 高靈敏度與特異性 – 成本相對低 – 適合細胞治療產品	– 無法區分活菌與死菌 – 需確效避免偽陽性/偽陰性	數小時至 1 天	≤10 CFU/mL 或 <100 GC/mL